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討論
如引言中所述，兩種主要的水文地球化學(xué)類型的地下水在O ki u t深度分層，被深度介于250和350 m之間的混合層隔開。因此，這種隨深度的變化為微生物多樣性和活動(dòng)提供了截然不同的地球化學(xué)環(huán)境。這些層的454個(gè)序列多樣性差異很大，ONK-PVA6地下水庫(kù)中大多數(shù)與RB相關(guān)的序列代表混合層（表6）。這與可培養(yǎng)微生物的結(jié)果（表3）以及之前關(guān)于混合層中硫酸鹽顯著還原為硫化物的觀察結(jié)果一致（P d s n等，2008）。相比之下，注入ONK-KR15的深層地下水系統(tǒng)呈現(xiàn)“沙漠狀”，可培養(yǎng)細(xì)胞的多樣性非常低，即只有兼性厭氧菌具有硝酸鹽還原能力（表3）。
值得注意的是，沒有硫酸鹽似乎從ONK-KR15地下水和生物膜序列庫(kù)中排除了RB相關(guān)序列。然而，的物種豐富度（即分類單元數(shù)&t;0%）和計(jì)算的序列多樣性指數(shù)（表6 ONK-KR15）略高于ONK-PVA6地下水。ONK-KR15序列庫(kù)中最豐富的序列與潛在的自養(yǎng)、利用屬有關(guān)氫的Hyd n p（Wi ms等人，1989）和假單胞菌屬，硫桿菌屬，和Fusib t（R v t等人，1999年）。用于培養(yǎng)的培養(yǎng)基沒有補(bǔ)充這些屬所使用的電子供體和受體，如氫和硫代硫酸鹽，這可能有利于它們的生長(zhǎng)。鑒于這些新結(jié)果，現(xiàn)在可以重新設(shè)計(jì)培養(yǎng)基以增加可培養(yǎng)微生物的種類。由于針對(duì)PCR引物古細(xì)菌的在該分析中未使用，因此分析ONKALO地下水中古細(xì)菌的完整多樣性的任務(wù)仍然存在。
觀察到的序列多樣性
在103天的實(shí)驗(yàn)時(shí)間和兩次處理中，生物膜的多樣性變化很?。▓D4）。OTU序列的比對(duì)分析以&t;3%的豐度出現(xiàn)，表明它們?cè)诘叵滤退兴姆N生物膜樣品之間是相同的，除了Hyd n p序列，樣品之間的OTU組成有所不同。類似地，作為ATP分析的生物量（表4）和生物膜多樣性在103天后幾乎沒有變化，這意味著ONK-KR15生物膜的多樣性水平恒定。生物膜經(jīng)過處理和時(shí)間的可重復(fù)454熱標(biāo)簽測(cè)序結(jié)果清楚地證明了DNA提取和454熱標(biāo)簽測(cè)序方法的可重復(fù)性和穩(wěn)健性，其中每個(gè)生物膜都可以被視為獨(dú)立的測(cè)序樣本。
觀察到的獨(dú)特OTU的數(shù)量在108-135個(gè)范圍內(nèi)（表6），比以前在K i發(fā)現(xiàn)的更多（i in t.2006）和芬諾斯堪底亞盾（P d s n等人。1996年,1997)使用克隆和測(cè)序的地下水，但比使用454熱標(biāo)簽測(cè)序在冰下水（即208-410個(gè)OTU；M t inss n等人2013），比深的海水中發(fā)現(xiàn)的（少了10次in等人。2006）。觀察到的454個(gè)序列與報(bào)告給nB nk的沉積物、鹽沼、地下水、污泥和湖水的序列大致相當(dāng)（表7）。然而，盡管相似性接近100%，但B st結(jié)果過于多樣化，無法得出關(guān)于從ONKALO觀察到的OTU的全球站點(diǎn)特異性的結(jié)論。
O ki u t的深層鹽水和微堿性地下水可能受到更深的超鎂鐵質(zhì)環(huán)境的影響，并持續(xù)蛇紋石化，這可以解釋觀察到的非常高濃度的甲烷和氫氣（w d L等人，1993).這樣地下環(huán)境似乎豐富Hyd n p別處（·布拉澤爾頓博士等人的2013）。在ONK-KR15的情況下提出了類似的富集，因?yàn)樵搶僭?54序列庫(kù)中占主導(dǎo)地位。少數(shù)百分比的古細(xì)菌數(shù)據(jù)集中序列與來自南非金礦深部含鹽地下水的T m p sm t序列有關(guān)（i in等人，2007年）。2006；高井等人。2001）。的主導(dǎo)地位Hyd n p OTU表明，深部地下生命的多樣性受環(huán)境參數(shù)控制，這些環(huán)境參數(shù)調(diào)節(jié)具有相關(guān)生理和代謝能力的各種屬的生長(zhǎng)和活動(dòng)。主要的相關(guān)參數(shù)是各種碳和電子供體和電子受體的存在與否。
硫酸鹽對(duì)RB多樣性和活性的影響
ONK-KR15和ONK-PVA6地下水在地球化學(xué)上的唯一主要區(qū)別是ONK-KR15地下水中不含硫酸鹽和硫化物（表1）。這種差異極大地影響了觀察到的可培養(yǎng)RB數(shù)量和RB的16 DNA多樣性，這在ONK-PVA6地下水中很大，而在ONK-KR15中幾乎不存在（圖4、表3和7）。由于硫酸鹽是混合層中主要的可用電子受體，甲烷可能是硫酸鹽還原的最大電子供體，其濃度是第二大潛在電子供體DOC的10倍（表1表和2）。然而，與甲烷不同，如果被微生物氧化，可以通過擴(kuò)散和地下水運(yùn)動(dòng)從富含甲烷的深層層不斷補(bǔ)充，DOC必須通過化學(xué)或光自養(yǎng)代謝過程合成。
在之前的一項(xiàng)研究中，在裝有ONK-PVA6地下水的FCC中觀察到最多產(chǎn)生320μM的醋酸鹽，推測(cè)醋酸鹽是由使用甲烷作為碳源的微生物產(chǎn)生的（P d s n 2013）。幾個(gè)在ONK-PVA6（所述RB的表7）被稱為完整乙氧化屬，即，D su f b t ium（B ys等人1987），D su f b u，和D su f ti num（Ku v等。2001）。因此，與乙酸鹽的存在及其可能從甲烷中產(chǎn)生的結(jié)果一致，目前和以前的結(jié)果表明，中深層富含硫酸鹽和深層富含甲烷的地下水的混合誘導(dǎo)了使用甲烷和乙酸鹽作為硫酸鹽還原微生物群落ONK-PVA6含水層中的關(guān)鍵電子和碳供體。
ONKALO隧道的建設(shè)導(dǎo)致富含硫酸鹽的地下水與深層富含甲烷的地下水混合。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，混合層在與ONKALO隧道相交的裂縫中緩慢移動(dòng)到更深處。ONK-PVA6鉆孔于2009年11月3日至4日鉆孔，當(dāng)時(shí)地下水缺乏硫酸鹽。截至2012年4月12日，由于水位下降，硫酸鹽濃度自那時(shí)起緩慢上升至1.9 mM。此處報(bào)告的FCC實(shí)驗(yàn)旨在模擬這種人類引起的地下水地球化學(xué)轉(zhuǎn)變，該轉(zhuǎn)變正在緩慢深入在ONKALO中，觸發(fā)混合層中的RB生長(zhǎng)。具有硫酸鹽還原能力的序列和培養(yǎng)物以相似的比例出現(xiàn)在富含硫酸鹽的FCC的地下水和生物膜中，即大約占細(xì)胞和序列總數(shù)的1%（表1和7）。因此，硫酸鹽是導(dǎo)致ONK-KR15地下水中RB生長(zhǎng)所需的唯一化合物。添加ONK-PVA6地下水對(duì)序列多樣性和可培養(yǎng)微生物數(shù)量的影響很小。
ONK-PVA6地下水具有代表序列D su f bu的，這是一種在硫酸鹽+ONK-PVA6生物膜中發(fā)現(xiàn)的OTU，但在硫酸鹽生物膜中沒有。否則，兩種處理沒有顯著差異。硫酸鹽作用緩慢，可培養(yǎng)RB的MPN增加需要60 d以上（圖3）。這與E的時(shí)間一致硫酸鹽FCC中接近–250 mV，這是一個(gè)典型的E，之前在FCC中觀察到RB活動(dòng)（P d s n 2012b）。雖然在對(duì)照生物膜454序列庫(kù)中沒有檢測(cè)到RB相關(guān)序列，但在稀有生物圈中可能仍然存在一些RB屬的細(xì)胞（in等人2006)硫酸鹽處理后可以生長(zhǎng)的FCC。因此，F(xiàn)CC實(shí)驗(yàn)證實(shí)了以下假設(shè)：硫酸鹽是在O ki u t缺乏硫酸鹽的深層地下水中引起RB生長(zhǎng)所需的唯一化合物。
高k米為37毫米的甲烷已被報(bào)道用于甲烷（AOM）處理的沉積物中的厭氧氧化（Z n等人2010）。如果甲烷是RB群落的主要電子供體，觀察到的細(xì)胞數(shù)量緩慢增加和硫酸鹽修正FCC序列庫(kù)中RB相關(guān)OTU的有限代表可能如此高K m與硫酸鹽AOM的有關(guān).因此，盡管硫酸鹽修正的FCC中可能一直在使用硫酸鹽AOM，但該過程可能太慢，無法在大約4.5 mM的表觀甲烷濃度下進(jìn)行檢測(cè)。
病毒（即攻擊地下水中微生物的噬菌體）的存在必須源自宿主微生物的裂解感染。A PO硬巖實(shí)驗(yàn)室地下水噬菌體豐富的調(diào)查返回大量多樣化的噬菌體人口（凱爾等人。2008年）。VLP與TNC的平均比率為12，表明微生物種群活躍。如果深層地下水中的噬菌體具有活性和裂解性，它們將構(gòu)成可能控制微生物數(shù)量和活動(dòng)的重要捕食者群體。此外，它們的存在表明它們的獵物——微生物——是活躍的并且正在生長(zhǎng)。VLP與TNC的比例在實(shí)驗(yàn)的前半部分很高，之后下降到2-4（圖1）。這種減少與硫酸鹽修正的FCC中NRB和RB的增加相吻合（圖2和b)。似乎噬菌體最初對(duì)FCC中的微生物細(xì)胞（尤其是RB）的數(shù)量產(chǎn)生了顯著的控制作用。
總之，這項(xiàng)工作證明了深層地下水組成與微生物多樣性之間存在明顯的關(guān)系。地下水中僅存在/不存在一種地球化學(xué)參數(shù)，即硫酸鹽，導(dǎo)致了非常大的群落轉(zhuǎn)變。因此，研究的地下微生物群落有能力通過表現(xiàn)群落轉(zhuǎn)變來響應(yīng)地球化學(xué)環(huán)境的變化。培養(yǎng)和454熱標(biāo)簽測(cè)序均表明RB群落在存在硫酸鹽的深層生物圈中非常具有競(jìng)爭(zhēng)力。由于RB活動(dòng)會(huì)產(chǎn)生對(duì)金屬具有腐蝕性的硫化物，因此在評(píng)估微生物過程對(duì)未來金屬罐中放射性廢物地質(zhì)處置的影響時(shí)，應(yīng)考慮這些結(jié)論。
致謝
由阿爾弗雷德P.斯隆基金會(huì)支持的深碳天文臺(tái)深生命普查計(jì)劃使熱標(biāo)簽測(cè)序數(shù)據(jù)成為可能。Py t測(cè)序是在海洋生物實(shí)驗(yàn)室（美國(guó)馬薩諸塞州伍茲霍爾）進(jìn)行的，我們?cè)谀抢锏玫搅薾 im、Hi y M is n、us n Hus、Mit in、J s p Vin is和And w V is的大力幫助。M it Y i-K i在ONKALO站點(diǎn)的協(xié)助是一流的，不可或缺的。作者感謝瑞典微生物分析的Bj?n H b k、J ssi J nss n和Lind J nss n，感謝他們出色的實(shí)驗(yàn)室工作。
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在硫酸鹽和甲烷梯度相反的情況下，地下微生物群落的多樣性受硫酸鹽控制——摘要、介紹
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