研究簡介:心肌缺血再灌注損傷常見于心臟血流恢復(fù)后，如在心臟病發(fā)作后的血液再通或心臟手術(shù)后。這種損傷會(huì)導(dǎo)致組織破壞，可能引起心力衰竭。損傷的一個(gè)主要原因是活性氧自由基（ROS）的過度產(chǎn)生，特別是在再灌注的最初幾分鐘內(nèi)。ROS的產(chǎn)生觸發(fā)線粒體通透性過渡孔的開放，導(dǎo)致細(xì)胞死亡程序、微血管功能障礙和炎癥級聯(lián)反應(yīng)。氫氣（H2）作為一種抗氧化劑，已經(jīng)顯示出在預(yù)防和治療缺血再灌注引起的致命損傷方面具有巨大潛力。H2具有選擇性減少細(xì)胞毒性ROS的能力，同時(shí)不影響代謝氧化還原反應(yīng)或破壞其他ROS參與的細(xì)胞信號傳導(dǎo)。H2能夠穿透生物膜，快速擴(kuò)散到細(xì)胞質(zhì)、線粒體和細(xì)胞核中，有效減少細(xì)胞毒性自由基。此外H2是一種對人類安全、無明顯副作用的氣體。盡管氫氣的治療效果已被廣泛證明，但將其應(yīng)用于臨床治療仍面臨挑戰(zhàn)。主要問題包括H2在水、鹽水或血液中的溶解度低，導(dǎo)致其在血液和受損組織中的生物利用度較差。此外，H2的易燃性在制備含H2配方時(shí)造成了困難和安全隱患。因此開發(fā)新的、安全的H2傳遞系統(tǒng)以有效治療具有重要意義。微泡是小的充氣微球，通常用于超聲診斷中作為對比增強(qiáng)劑。MBs也是重要的藥物傳遞載體，可以在血液循環(huán)中穩(wěn)定攜帶藥物，并具有多種治療應(yīng)用。藥物可以加載到MB殼上、嵌入到殼矩陣中，或加載到內(nèi)部空間中。MBs作為封裝治療性氣體的載體，為提高H2的生物利用度提供了新的可能性。本研究人員開發(fā)了一種超聲可視的H2傳遞系統(tǒng)，通過將H2裝載在微泡內(nèi)（H2-MBs）來預(yù)防心肌缺血再灌注損傷。這種系統(tǒng)可以在常溫和常壓條件下大大提高單位體積中的H2濃度，并且H2-MBs可以在超聲成像系統(tǒng)中進(jìn)行可視跟蹤，有效釋放其治療氣體。提供了一種新的方法來提高氫氣在生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中的有效性，特別是在預(yù)防心肌缺血再灌注損傷方面。通過使用H2-MBs，研究人員能夠克服H2溶解度低和生物利用度差的問題，同時(shí)利用超聲成像技術(shù)實(shí)現(xiàn)對H2輸送的實(shí)時(shí)監(jiān)控。

Unisense微電極研究系統(tǒng)的應(yīng)用

使用Unisense氫氣微電極在體外（磷酸鹽緩沖鹽溶液）和體內(nèi)（大鼠心臟）環(huán)境中測量了從微泡中釋放的H2的濃度。使用針式H2傳感器（Unisense）在磷酸鹽緩沖鹽溶液（PBS）和血液中測量H2釋放曲線。簡要地說，向5mL PBS中加入0.2 mL H2-MBs或?qū)φ誐Bs（載體）。然后通過將針式H2傳感器浸入MB懸浮液中并實(shí)時(shí)記錄數(shù)據(jù)來確定H2釋放曲線。對于體內(nèi)H2釋放曲線，將針式H2傳感器插入五只健康大鼠的左心室（動(dòng)脈血），并通過靜脈注射向大鼠注入2×1010 H2-MBs或?qū)φ誐Bs。然后連續(xù)記錄血液中H2的濃度。開發(fā)了一種新穎的、圖像引導(dǎo)的治療性H2輸送系統(tǒng)，簡單易用，由此產(chǎn)生的H2-MBs極大地提高了單位體積溶液中的H2溶解度。更重要的是，H2-MBs可以被視覺跟蹤，并用于保護(hù)心肌缺血再灌注損傷。研究為基于H2的治療應(yīng)用的臨床轉(zhuǎn)化提供了潛在解決方案。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

開發(fā)了一種新穎的、圖像引導(dǎo)的治療性H2輸送系統(tǒng)，簡單易用，由此產(chǎn)生的H2-MBs極大地提高了單位體積溶液中的H2溶解度。更重要的是，H2-MBs可以被視覺跟蹤，并用于保護(hù)心肌缺血再灌注損傷。研究為基于H2的治療應(yīng)用的臨床轉(zhuǎn)化提供了潛在解決方案。

圖1、H2-MBs的制備和表征。（a）H2-MBs制備的示意圖。將由DSPC和DSPE-PEG2000（摩爾比=90:10）組成的15毫克磷脂混合物溶解在氯仿中。在形成膜和水合后，將含水分散液（脂質(zhì)體）裝入4 mL瓶中（每瓶1 mL），并用八氟丙烷（C3F8）置換瓶中的空氣。隨后，顛倒瓶子，并用注射器注入一定量的H2。因此，瓶子中擠出相等體積的C3F8。震動(dòng)45秒后獲得H2-MBs。（b）從上述方法中獲得的H2-MBs的代表性圖像（C3F8/H2比為1:1）。（c、d）體內(nèi)外H2釋放的代表性時(shí)間曲線。在體外實(shí)驗(yàn)中，將4×109 H2-MBs或?qū)φ誐Bs（載體）加入5 mL PBS中，并使用針式H2傳感器檢測來自MBs的H2釋放。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，將2×1010 H2-MBs或?qū)φ誐Bs靜脈注射到大鼠體內(nèi)，并使用針式H2傳感器連續(xù)記錄血液中的H2濃度，該傳感器插入LV腔中（n=5）。箭頭表示添加H2-MBs或?qū)φ誐Bs的時(shí)間。

圖2、H2-MBs的超聲信號檢測。（a）H2-MBs分散在各種濃度（5×105、5×106、5×107、5×108和5×109/mL）的PBS中的超聲圖像。使用Vevo 2100超聲成像系統(tǒng)進(jìn)行成像。（b）PBS中H2-MBs的超聲信號強(qiáng)度的定量分析。（c）大鼠心臟LV中H2-MBs在靜脈尾部注射H2-MBs前后的超聲圖像。使用Vevo 2100超聲成像系統(tǒng)進(jìn)行成像（n=3）。上排，注射H2-MBs前；下排，注射H2-MBs后；左側(cè)面，B模式圖像；右側(cè)面，對比模式圖像；LV，左心室（點(diǎn)線循環(huán)）。（d）H2-MBs注射進(jìn)入大鼠后300秒的時(shí)間-強(qiáng)度曲線。箭頭表示MB注射的時(shí)間。（e）大鼠心肌組織中H2-MB輸送的超聲圖像。使用Philips IE33超聲機(jī)進(jìn)行成像。左側(cè)，注射H2-MBs前；右側(cè)，注射H2-MBs后；LV，左心室（紅色循環(huán)）；IVS，心室間隔（藍(lán)色循環(huán)）；RV，右心室（綠色循環(huán)）。箭頭表示靜脈注射H2-MBs后H2-MB輸送到大鼠心肌組織中的情況。（f）H2-MBs的超聲信號強(qiáng)度的定量分析。

圖3、H2-MBs預(yù)防心肌梗死。（a）給予對照微泡（左）或H2-MBs（右，高劑量）處理的大鼠經(jīng)TTC染色的心肌連續(xù)切片的代表性圖像。被染色陽性（紅色）的組織代表活力心肌。未染色陽性（白色）的心肌代表梗死組織。（b）對于接受假手術(shù)處理的、接受車輛處理的或接受H2-MB處理的大鼠（低劑量，每只大鼠4×109氣泡；高劑量，每只大鼠2×1010氣泡）在LCA缺血30分鐘和再灌注24小時(shí)后的心肌梗死面積的定量測定。接受H2-MB處理的大鼠顯示出INF/LV顯著減少（n=7）。*P<0.05，**P<0.01。數(shù)據(jù)表示平均值±s.d。（c）對于接受假手術(shù)處理的、接受對照MB處理的或接受H2-MB處理的大鼠在LCA缺血30分鐘和再灌注3小時(shí)后的心肌梗死面積的定量測定；每只H2-MB處理的大鼠使用2×1010個(gè)H2-MBs。發(fā)現(xiàn)了類似的保護(hù)作用（n=5）。

圖4、H2-MBs減少不良的LV重塑。（a）接受假手術(shù)處理（假手術(shù)）、缺血再灌注對照微泡處理或缺血再灌注H2-MBs處理的大鼠的代表性M模式超聲心動(dòng)圖像。對每組的M模式超聲圖像的測量是在缺血再灌注后48小時(shí)進(jìn)行的。使用裝備有MS-250掃描頭探頭的Vevo 2100系統(tǒng)進(jìn)行成像，掃描速度為1000 Hz，頻率為21 MHz?？潭葪l（垂直），4 mm。（b）基于超聲心動(dòng)圖像，確定了LV尺寸，包括左室舒張末期直徑（LVEDD）和左室收縮末期直徑（LVESD）（n=5）。**P<0.01。數(shù)據(jù)表示平均值±s.d。（c）與對照組相比，H2-MB處理的大鼠的心臟收縮功能（FS％）和射血分?jǐn)?shù)（EF％）顯著改善（n=5）。

圖5、H2-MBs保護(hù)心肌結(jié)構(gòu)并減少心肌細(xì)胞凋亡。（a）來自接受假手術(shù)處理、車輛處理或H2-MB處理的大鼠的心臟切片的組織學(xué)分析，這些大鼠經(jīng)過30分鐘缺血和24小時(shí)再灌注；這些切片的H＆E染色如圖所示（上排）。接受對照微泡MB的大鼠心臟在缺血區(qū)顯示明顯出血和壞死（上排，中間），但H2-MBs處理的大鼠的心肌損傷減輕了（上排，右側(cè)）。進(jìn)行了TUNEL染色以檢測心肌細(xì)胞的凋亡（中排），發(fā)現(xiàn)接受車輛MB的大鼠中TUNEL陽性細(xì)胞的數(shù)量顯著增加（中排，中間）與接受假手術(shù)處理的大鼠相比（中排，左側(cè)）。接受H2-MBs的大鼠顯示TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)量顯著減少（中排，右側(cè)）。進(jìn)行了免疫組化染色以檢測caspase-3的表達(dá)（下排），發(fā)現(xiàn)接受對照微泡MB的大鼠心肌中的caspase-3表達(dá)相對較高（下排，中間）與接受假手術(shù)處理的大鼠相比（下排，左側(cè)）。接受H2-MBs的大鼠顯示caspase-3表達(dá)減少（下排，右側(cè)）；刻度條=50μm。（b）通過計(jì)算五個(gè)高倍視野中TUNEL陽性核的百分比來繪制凋亡指數(shù)圖，顯示H2-MB處理的大鼠中TUNEL陽性核的數(shù)量顯著減少與車輛組相比（n=5）。

結(jié)論與展望

缺血再灌注誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞死亡是全球發(fā)病率和死亡率的主要原因。氫氣（H2）作為一種抗氧化劑，已經(jīng)顯示出在預(yù)防和治療缺血再灌注引起的致命損傷方面具有巨大潛力。然而由于H2在水中溶解度較低，在血液和受損組織中的生物利用度較差。研究者在研究過程中使用Unisense氫氣微電極在體外（磷酸鹽緩沖鹽溶液）和體內(nèi)（大鼠心臟）環(huán)境中測量了從微泡中釋放的H2的濃度。這有助于了解H2-MBs（載氫微泡）釋放H2的動(dòng)態(tài)過程和速率。通過監(jiān)測H2的釋放情況，研究者能夠評估H2-MBs在模擬的生理?xiàng)l件下（如PBS）以及在活體動(dòng)物中的性能。這對于驗(yàn)證H2-MBs作為藥物傳遞系統(tǒng)的有效性至關(guān)重要。在這里研究人員開發(fā)了一種超聲可視的H2傳遞系統(tǒng)，通過將H2裝載在微泡內(nèi)（H2-MBs）來防止心肌缺血再灌注損傷。使用該系統(tǒng)可以在常溫和常壓條件下大大提高單位體積中的H2濃度。H2-MBs可以在超聲成像系統(tǒng)中進(jìn)行可視跟蹤，并能有效釋放其治療氣體。在缺血再灌注開始時(shí)在活體系統(tǒng)中輸注H2-MBs會(huì)導(dǎo)致明顯減小的梗死區(qū)大小和病理重塑。進(jìn)一步分析表明，這種方法顯著抑制了心肌細(xì)胞凋亡，并減少了心肌缺血再灌注大鼠中的心肌炎癥和氧化損傷。這些結(jié)果表明，H2-MBs是一種有前途的H2基治療應(yīng)用的可視傳遞系統(tǒng)。本研究提供了一種新的方法來提高氫氣在生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中的有效性，特別是在預(yù)防心肌缺血再灌注損傷方面。通過使用H2-MBs，研究人員能夠克服H2溶解度低和生物利用度差的問題，同時(shí)利用超聲成像技術(shù)實(shí)現(xiàn)對H2輸送的實(shí)時(shí)監(jiān)控。雖然Unisense微電極系統(tǒng)本身不提供成像功能，但它們測量的H2濃度數(shù)據(jù)可以用來驗(yàn)證超聲成像觀察到的H2-MBs分布和行為，為本研究提供了一種精確、可靠的工具來測量和監(jiān)測H2-MBs釋放的H2濃度，這對于評估這種新型藥物傳遞系統(tǒng)的性能和潛力至關(guān)重要。