干細(xì)胞衍生的腦類器官是模仿胚胎大腦結(jié)構(gòu)人工培育的微型器官。它們由多種神經(jīng)細(xì)胞類型組成，具有3D細(xì)胞層組織，表現(xiàn)出局部場(chǎng)電位。為了監(jiān)測(cè)厚球形樣本的類器官內(nèi)電活動(dòng)，此項(xiàng)研究開(kāi)發(fā)了能夠穿透腦類器官內(nèi)部區(qū)域的長(zhǎng)突起微電極陣列，以測(cè)量類器官內(nèi)神經(jīng)元的局部電位。研究者們開(kāi)發(fā)出了一種新的微加工工藝，可以在垂直上升的超過(guò)兩百微米的橫梁頂端制造突出的懸臂微電極陣列。這些細(xì)長(zhǎng)的橫梁深深插入類器官內(nèi)，可以記錄埋藏在類器官內(nèi)的神經(jīng)元的局部場(chǎng)電位。這種新型裝置將為更詳細(xì)地研究神經(jīng)功能提供寶貴的工具。

研究思路

Methods開(kāi)發(fā)一種新的微加工工藝，用于制造長(zhǎng)的突出式微電極陣列（csMEA），以測(cè)量類器官內(nèi)神經(jīng)元的局部電位。為了實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)，研究人員首先設(shè)計(jì)了一個(gè)新的微加工流程，然后使用該流程制造了突出式微電極陣列。研究人員將突出式微電極陣列應(yīng)用于人類大腦類器官中，以測(cè)量神經(jīng)元的電位。最后對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行了分析和討論，探討了該技術(shù)在神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的潛在應(yīng)用。

主要結(jié)果

ResultsMEA設(shè)計(jì)研究人員設(shè)計(jì)了一種csMEA，該陣列由許多微小的彎曲和尖銳的微電極組成，可以穿透組織并靈敏地記錄局部場(chǎng)電位。為了制造這種陣列，研究人員使用了一種新的微加工技術(shù)，該技術(shù)可以制造出足夠尖銳和細(xì)長(zhǎng)的微電極，以直接穿透類器官并進(jìn)行電位測(cè)量。此外，研究人員還設(shè)計(jì)了一個(gè)PDMS環(huán)，用于將類器官固定在突出式微電極陣列上。為了制造這種陣列，研究人員使用了一種復(fù)雜的微細(xì)加工流程。該流程包括四個(gè)層次的掩膜制作，制作過(guò)程從清洗玻璃基板開(kāi)始，然后在基板上蒸發(fā)一層厚度為300μm的鋁膜。使用掩膜制作技術(shù)，將鋁膜刻蝕成所需的形狀。然后使用PDMS制作技術(shù)制作懸臂式結(jié)構(gòu)，并將其與微電極陣列結(jié)合在一起。最后使用化學(xué)腐蝕技術(shù)將鋁膜層溶解，從而形成懸臂式結(jié)構(gòu)。

圖1(a)MEA的橫截面示意圖。(b)在傳統(tǒng)平面MEA上放置大腦類器官的示意圖以及類器官插入尖刺微電極的示意圖。(c)功能MEA的照片，顯示PDMS內(nèi)環(huán)和外環(huán)。(d)顯示與實(shí)際光刻掩模相對(duì)應(yīng)的4個(gè)不同層次的MEA布局。(e)植入MEA并用PDMS環(huán)固定的類腦的3D示意圖。

光束釋放

光束釋放是一種微細(xì)加工技術(shù)，用于制造懸臂式MEA。該技術(shù)利用了光的能量來(lái)釋放懸臂式結(jié)構(gòu)，從而形成微電極陣列。

圖2尖頭電極微細(xì)加工原理示意圖（a）。蝕刻完成后，運(yùn)動(dòng)的橫梁會(huì)放松內(nèi)應(yīng)力并伸直（b）。(c)微光束陣列在光束釋放前后的光學(xué)照片。(d)整個(gè)陣列的掃描電子顯微鏡圖像，(e)顯示每個(gè)光束上活性區(qū)域的光束細(xì)節(jié)。光束正確曲率（f）和過(guò)度曲率（g）示例。(h)一根懸臂末端活動(dòng)區(qū)域的細(xì)節(jié)。

圖3(上圖）分析機(jī)械問(wèn)題的示意圖和長(zhǎng)度不斷增加的松弛懸臂梁的掃描電鏡照片，顯示了圓形變形形狀以及曲率半徑的測(cè)量結(jié)果。(下圖）曲率半徑與懸臂厚度的關(guān)系，分析模型（藍(lán)線）與測(cè)量結(jié)果（紅點(diǎn)）的比較。

機(jī)械建模

在計(jì)算受到壓力和力矩作用的機(jī)械梁和懸臂的變形形狀時(shí)，可以使用歐拉-伯努利理論或Timoshenko-Ehrenfest梁理論來(lái)建立更精細(xì)的模型。接下來(lái)評(píng)估懸臂深入插入hESC衍生腦類器官的能力。為此，研究者們開(kāi)發(fā)了具有突出懸臂的相同裝置，為了不影響顯微鏡觀察，沒(méi)有使用金屬層，而是使用與浸入式透鏡兼容的薄玻璃。為了進(jìn)一步了解光束插入類器官的空間情況，對(duì)懸臂插入的類器官進(jìn)行了共聚焦和光片顯微鏡分析。用PLL-FITC標(biāo)記懸臂，通過(guò)在SiO2和Si3N4上附著聚賴氨酸將熒光素粘合到懸臂上，以便用熒光顯微鏡觀察懸臂。3D觀察清楚地表明，橫梁插入了類器官中（圖4d-f）。

用掃描電鏡（SEM）觀察懸臂上被刺穿的類器官。在進(jìn)行掃描電子顯微鏡分析時(shí)，除了固定和干燥外，沒(méi)有對(duì)類器官進(jìn)行任何特殊處理。結(jié)果證實(shí)了微光束確實(shí)穿透了類器官。如圖4b所示，研究首次使用平面MEA對(duì)腦類器官進(jìn)行了電生理學(xué)實(shí)驗(yàn)。研究者開(kāi)發(fā)了穿透性懸臂，以獲得類器官內(nèi)部的電活動(dòng)。結(jié)果顯示，可以在所有類器官中檢測(cè)到自發(fā)信號(hào)，每個(gè)電極的平均點(diǎn)燃率為每分鐘0.5個(gè)尖峰（圖5d）。將刺入的類器官在MEA上培養(yǎng)了17天，再次進(jìn)行電記錄時(shí)，可以看到它們保持了類似的發(fā)射率（圖5d），這表明該過(guò)程在很長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)都是可靠的。這些結(jié)果表明，將微電極放置在插入腦器質(zhì)性模型內(nèi)部的懸臂上，能夠測(cè)量因電活躍細(xì)胞的電活動(dòng)而產(chǎn)生的局部電位，其振幅可達(dá)幾百微伏，具有典型的細(xì)胞外記錄形狀。

圖4源自hESC的皮質(zhì)類器官及其csMEA植入物的表征。(a)用3毫米PDMS環(huán)固定在懸臂MEA中心的大腦皮質(zhì)類器官的透射光顯微鏡觀察；(b)放置在錐形MEA頂部的大腦皮質(zhì)類器官的透射光顯微鏡觀察。(c)干燥后懸掛在懸臂MEA上的腦類器官的掃描電子顯微鏡。(d)共焦圖像采集：將類器官植入csMEA。(e)懸臂附近細(xì)胞的共聚焦成像。(f)類器官脫離csMEA但懸臂仍在其內(nèi)的光片成像。

圖5懸臂微電極顯示類器官內(nèi)部自發(fā)的電活動(dòng)。(a)對(duì)整個(gè)csMEA陣列進(jìn)行的5分鐘電記錄，以及csMEA陣列的代表性照片和示意圖。(b)在植入csMEA 3天和17天后，測(cè)量植入csMEA的單個(gè)類器官的自發(fā)活動(dòng)尖峰。(c)用一個(gè)電極記錄的類器官植入后24小時(shí)和4天的信號(hào)軌跡和截圖。隨著時(shí)間的推移，記錄到的信號(hào)越來(lái)越強(qiáng)，可達(dá)數(shù)百微伏。(d)植入csMEA 3天和17天的腦類器官細(xì)胞的平均發(fā)射率。

總結(jié)

本研究成功制造出了一種新型csMEA和懸臂式MEA，并且對(duì)這兩種陣列進(jìn)行了電位測(cè)量和性能測(cè)試。研究人員還比較了這兩種陣列的性能，并發(fā)現(xiàn)突出式微電極陣列具有更高的信噪比和更好的空間分辨率，而懸臂式MEA則具有更好的機(jī)械穩(wěn)定性和更高的靈敏度。此外，研究人員還使用這兩種陣列對(duì)腦類器官進(jìn)行了電位測(cè)量，并成功記錄到了神經(jīng)元的活動(dòng)信號(hào)。這兩種新型的微電極陣列，為神經(jīng)科學(xué)研究提供了新的工具。這些陣列具有高精度、高效率和可重復(fù)性的優(yōu)點(diǎn)，可以用于記錄神經(jīng)元的活動(dòng)信號(hào)，并研究神經(jīng)系統(tǒng)的功能和疾病機(jī)制。此外，本文還介紹了一些新的微細(xì)加工技術(shù)，如光束釋放和PDMS環(huán)制作技術(shù)，這些技術(shù)可以用于制造其他類型的微電極陣列和微型傳感器。因此，本文的研究成果對(duì)于微電子學(xué)和神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的研究具有重要的意義。