2植物細(xì)胞pH值熒光顯微成像

與Ca2+相似，質(zhì)子作為帶電離子必須嚴(yán)格控制在合適的濃度。H+參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、而且直接影響植物發(fā)育。鑒于此，測量細(xì)胞pH是植物學(xué)家們的一個(gè)重要目標(biāo)。傳統(tǒng)上講，人們一般用選擇性質(zhì)子微電極等方法來對細(xì)胞pH進(jìn)行測量。這些技術(shù)雖得到應(yīng)用，但有很多不足，如分辨率低、時(shí)間響應(yīng)滯后等。傳統(tǒng)的測細(xì)胞pH值的微電極方法，在實(shí)踐上仍有很多不足。由于pH在細(xì)胞內(nèi)也是動(dòng)態(tài)變化的，因此用熒光指示劑捕獲這一動(dòng)態(tài)變化過程，是測定pH極佳的方法。

2.1質(zhì)外體pH

質(zhì)外體是植物細(xì)胞膜外區(qū)域，包括細(xì)胞壁、細(xì)胞間隙和木質(zhì)部。這一區(qū)域的離子環(huán)境會(huì)影響物質(zhì)的跨膜運(yùn)輸，尤其直接影響根部的營養(yǎng)吸收和溶質(zhì)傳輸。細(xì)胞壁的pH也調(diào)整其延展性與穩(wěn)定性、進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞形狀的大小。植物激素在質(zhì)外體的運(yùn)輸，也會(huì)受到質(zhì)子化水平的影響。撇開細(xì)胞壁pH對植物眾多生理功能的影響不談，測定其數(shù)值仍然是確定質(zhì)外體pH對生長發(fā)育調(diào)控的關(guān)鍵。有許多方法都是利用共聚焦顯微鏡來觀察熒光探針對質(zhì)外體pH的標(biāo)記。指示劑一般是用熒光粉或其衍生物來充當(dāng)。熒光粉染料通常被用來作為雙重激發(fā)態(tài)比例指示劑，即一方面其一個(gè)激發(fā)態(tài)峰值的形成完全不依賴于細(xì)胞pH值、另一方面其第二個(gè)激發(fā)態(tài)峰值的形成完全依賴pH值。細(xì)胞pH值可根據(jù)二者激發(fā)態(tài)強(qiáng)度變化，按比例計(jì)算出來。目前細(xì)胞pH值的測定大體都按這種方式進(jìn)行，代表著該技術(shù)的新方向。

2.2細(xì)胞質(zhì)pH監(jiān)測

由于細(xì)胞溶質(zhì)是強(qiáng)緩沖液、加之H+-ATP質(zhì)子泵和多聚焦磷酸化的作用，植物細(xì)胞pH一般情況下維持在7.2左右。H+-ATP質(zhì)子泵一般定位在細(xì)胞質(zhì)膜和內(nèi)膜上，其工作結(jié)果是去除胞質(zhì)過多H+。最近有研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞質(zhì)pH值也受到了精巧的調(diào)節(jié)、以期響應(yīng)外界刺激或植株生長。

當(dāng)前，靈敏的熒光pH探針與高分辨率的空間圖像相偶聯(lián)，不僅使得人們可以使用熒光顯微鏡觀察亞細(xì)胞水平pH值的不均一性、而且可以觀察到不同細(xì)胞pH值的動(dòng)態(tài)變化。基于熒光顯微鏡使用的靈敏細(xì)胞質(zhì)pH熒光染料一直是觀察和測定胞質(zhì)pH的首選方法。目前，胞質(zhì)pH熒光蛋白瞬時(shí)表達(dá)技術(shù)受到研究和使用者的歡迎，該技術(shù)還在發(fā)展之中。

3植物細(xì)胞ROS活體原位成像

3.1單線態(tài)氧細(xì)胞成像探針

3.2超氧陰離子細(xì)胞成像

圖2 4 d擬南芥根尖50-μM H2DCF-DA染色結(jié)果

(a)H2DCF-DA染色和加載的時(shí)間進(jìn)程；(b)單個(gè)根尖細(xì)胞光漂白、染料吸收和泄漏，以及氧化還原勢的不同復(fù)合狀態(tài)；(c)根尖加載H2DCF-DA 10 min后,激光共聚焦顯微成像，然后再根據(jù)要求掃描目標(biāo)區(qū)域活性氧；(d)總作用時(shí)間為26 s，掃描結(jié)束后，表皮外周細(xì)胞染色因光漂白逐漸變暗，而毗鄰的細(xì)胞因成像脅迫誘導(dǎo)產(chǎn)生ROS變亮。

3.3過氧化氫顯像探針

二氨基聯(lián)苯(3,3-Diaminobenzidine，DAB)是水溶性有機(jī)化合物，能與過氧化氫(H2O2)起反應(yīng)，生成深褐色多聚物。與NBT使用方式相仿，DAB被用來進(jìn)行植物生物脅迫或傷害脅迫條件下H2O2原位顯色。值得注意的是DAB對植物細(xì)胞有毒性，并且易于被光降解。熒光素衍生物2,7-二氯熒光黃(dihydrodichlorofluorescein diacetate，H2DCF-DA)目前被廣泛作為過氧化氫實(shí)時(shí)顯像熒光探針。由于與H2O2的高反應(yīng)活性且可以直接通過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞，H2O2已被普遍用來監(jiān)測植物細(xì)胞H2O2的積累(圖2)。與其他ROS染料或傳感器相比，H2DCF-DA具有可視化程度高、加載進(jìn)入細(xì)胞方便等優(yōu)點(diǎn)，但是該染料探針在完整細(xì)胞內(nèi)不穩(wěn)定、易于發(fā)生光氧化或光猝滅作用。在應(yīng)用中宜快、不宜慢。

4總結(jié)和展望

熒光探針為確定植物細(xì)胞Ca2+、pH和ROS的時(shí)空動(dòng)態(tài)變化提供了一個(gè)強(qiáng)有力的工具和辦法。隨著人們對熒光探針與目標(biāo)信號(hào)分子相互作用模式認(rèn)識(shí)的深入，這些探針在對信號(hào)分子定量分析方面將起十分重要的作用。盡管本文討論僅限于Ca2+、pH和ROS探針，但是更廣泛的染料和修飾化GFP熒光蛋白感受器、已經(jīng)被用來監(jiān)測G-蛋白活性、蔗糖濃度和酶活性等。熒光蛋白感受器的出現(xiàn)，使得顯微成像更為容易、尤其是用于轉(zhuǎn)化細(xì)胞、可以免除染料添加等定位試驗(yàn)。期待著能有一個(gè)熒光蛋白數(shù)據(jù)庫資源，屆時(shí)亞細(xì)胞信號(hào)定位方面的試驗(yàn)開展將更為便捷，也可以豐富人們對亞細(xì)胞信號(hào)動(dòng)態(tài)變化的理解。目前，由于可以獲取多個(gè)熒光探針，因而可以同時(shí)測定多個(gè)細(xì)胞位點(diǎn)多個(gè)參數(shù)。這種多渠道獲取的熒光圖像，無疑對于我們確定亞細(xì)胞水平上標(biāo)志性信號(hào)元件、有至關(guān)重要的作用。